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蛋白表达专题

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蛋白表达系统

蛋白表达系统概述

蛋白表达系统是指由宿主、外源基因、载体和辅助成分组成的体系。通过这个体系可以实现外源基因在宿主中表达的目的。一般由以下几个部分组成:

1、宿主。表达蛋白的生物体。可以为细菌、酵母、植物细胞、动物细胞等。由于各种生物的特性不同,适合表达蛋白的种类也不相同。

2、载体。载体的种类与宿主相匹配。根据宿主不同,分为原核(细菌)表达载体、酵母表达载体、植物表达载体、哺乳动物表达载体、昆虫表达载体等。载体中含有外源基因片段。通过载体介导,外源基因可以在宿主中表达。

3、辅助成分。有的表达系统中还包括了协助载体进入宿主的辅助成分。比如昆虫-杆状病毒表达体系中的杆状病毒。

蛋白表达科学研究

rBPI56或其功能性氨基端片段通常在真核细胞中表达,将有助于获得具有生物学活性抗G菌重组蛋白。但因该种表达方式存在成本高、表达量低等问题而影响其实际应用。用原核细胞表达BPI23-Fcγ1重组蛋白。

Profinity eXact融合标签表达系统:利用bio-rad rofinity eXact 系统制备无标签、N 端无任何其它残基 的重组蛋白只需大约1 小时。该亲和介质较为稳定,可多次用于目的蛋白的纯化,从而节约了 成本。适用于纯化以不溶的聚集体形式存在的重组蛋白。Profinity eXact 融合标签系统的有效性和一致性将使其成为获得高产率无标签重组蛋白的通用平台。

蛋白表达系统分类及优劣分析

原核蛋白表达系统既是最常用的表达系统,也是最经济实惠的蛋白表达系统。原核蛋白表达系统以大肠杆菌表达系统为代表,具有遗传背景清楚、成本低、表达量高和表达产物分离纯化相对简单等优点,缺点主要是蛋白质翻译后缺乏加工机制,如二硫键的形成、蛋白糖基化和正确折叠,得到具有生物活性的蛋白的几率较小。

酵母蛋白表达系统以甲醇毕赤酵母为代表,具有表达量高,可诱导,糖基化机制接近高等真核生物,分泌蛋白易纯化,易实现高密发酵等优点。缺点为部分蛋白产物易降解,表达量不可控。

哺乳动物细胞和昆虫细胞表达系统主要优点是蛋白翻译后加工机制最接近体内的天然形式,最容易保留生物活性,缺点是表达量通常较低,稳定细胞系建立技术难度大,生产成本高。

大肠杆菌表达系统

在各种表达系统中,最早被采用进行研究的是大肠杆菌表达系统,也是目前掌握最为成熟的表达系统,大肠杆菌表达系统以其细胞繁殖快速产量高、IPTG诱导表达相对简便等优点成为生产重组蛋白的最常用的系统。

对于表达不同的蛋白,需要采用不同的载体。目前已知的大肠杆菌的表达载体可分为非融合型表达载体和融合型表达载体两种。非融合表达是将外源基因插到表达载体强启动子和有效核糖体结合位点序列下游,以外源基因mRNAAUG为起始翻译,表达产物在序列上与天然的目的蛋白一致。融合表达是将目的蛋白或多肽与另一个蛋白质或多肽片段的DNA序列融合并在菌体内表达。融合型表达的载体包括分泌表达载体、带纯化标签的表达载体、表面呈现表达载体、带伴侣的表达载体。

大肠杆菌表达系统优点在于遗传背景清楚、繁殖快、成本低、表达量高、表达产物容易纯化、稳定性好、抗污染能力强以及适用范围广等。

酵母表达系统

酵母表达系统作为一种后起的外源蛋白表达系统,由于兼具原核以及真核表达系统的优点,正在基因工程领域中得到日益广泛的应用,应用此系统可高水平表达蛋白,且具有翻译后修饰功能,故被认可为一种表达大规模蛋白的强有力的工具。

常用的酵母表达系统:

一,酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)表达系统:

酿酒酵母(Saecharomycescerevisiae)在酿酒业和面包业的使用已有数千年的历史,被认为是GRAS(generally recognized as safe)生物,不产生毒素,已被美国FDA确认为安全性生物,但酿酒酵母难于高密度培养,分泌效率低,几乎不分泌分子量大于30 kD的外源蛋白质,也不能使所表达的外源蛋白质正确糖基化,而且表达蛋白质的C端往往被截短。因此,一般不用酿酒酵母做重组蛋白质表达的宿主菌

二,甲醇营养型酵母表达系统:

甲醇酵母表达系统是目前应用最广泛的酵母表达系统。目前甲醇酵母主要有汉森酵母属(Hansenula),毕赤酵母属(Pichia),球拟酵母属(Torulopsis)等,并以毕赤酵母属(Pichia)应用最多。

甲醇酵母的表达载体为整合型质粒,载体中含有与酵母染色体中同源的序列,因而比较容易整合入酵母染色体中,大部分甲醇酵母的表达载体中都含有甲醇酵母醇氧化酶基因—1(AOX1),在该基因的启动子(PAOX1)作用下,外源基因得以表达。甲醇酵母一般先在含甘油的培养基中生长。培养至高浓度。再以甲醇为碳源。诱导表达外源蛋白。这样可以大大提高表达产量。利用甲醇酵母表达外源性蛋白质其产量往往可达克级。与酿酒酵母相比其翻译后的加工更接近哺乳动物细胞,不会发生超糖基化。

酵母表达的特点酵母是一种单细胞低等真核生物,培养条件普通,生长繁殖速度迅速,能够耐受较高的流体静压,用于表达基因工程产品时,可以大规模生产,有效降低了生产成本。

昆虫表达系统

昆虫表达系统是一类应用广泛的真核表达系统,它具有同大多数高等真核生物相似的翻译后修饰加工以及转移外源蛋白的能力。昆虫杆状病毒表达系统是目前国内外十分推崇的真核表达系统。利用杆状病毒结构基因中多角体蛋白的强启动子构建的表达载体,可使很多真核目的基因得到有效甚至高水平的表达。它具有真核表达系统的翻译后加工功能,如二硫键的形成、糖基化及磷酸化等,使重组蛋白在结构和功能上更接近天然蛋白;其最高表达量可达昆虫细胞蛋白总量的50%;可表达非常大的外源性基因(200kD);具有在同一个感染昆虫细胞内同时表达多个外源基因的能力;对脊椎动物是安全的。由于病毒多角体蛋白在病毒总蛋白中的含量非常高,至今已有很多外源基因在此蛋白的强大启动子作用下获得高效表达。常用的杆状病毒包括苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒(AcNPV)和家蚕型多角体病毒(BmNPV),常用的宿主细胞则来源于草地夜蛾Sf9细胞,用于表达外源基因的质粒来源于PUC系列,其含有一个多克隆位点和多角体蛋白启动子。 [2]

杆状病毒系统的主要优点包括:

1,组蛋白具有完整的生物学功能,如蛋白的正确折叠、二硫键的搭配

2,蛋白翻译后的加工修饰;

3,表达水平高,可达总蛋白量的50%

4,可容纳大分子的插入片段;

5,能同时表达多个基因。主要缺点是外源蛋白表达处于极晚期病毒启动子的调控之下,这时由于病毒感染,细胞开始死亡。

哺乳动物表达系统

哺乳动物细胞表达外源重组蛋白可利用质粒转染和病毒载体的感染。利用质粒转染获得稳定的转染细胞需几周甚至几个月时间,而利用病毒表达系统则可快速感染细胞,在几天内使外源基因整合到病毒载体中,尤其适用于从大量表达产物中检测出目的蛋白。哺乳动物细胞表达载体必须包含原核序列、启动子、增强子、选择标记基因、终止子和多聚核苷酸信号等控制元件。


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